cDNA 全称互补 DNA，它是以成熟的 mRNA 也就是信使 RNA 作为模板，依靠逆转录酶催化，经过反转录反应合成得到的双链 DNA，核心原料是四种脱氧核苷三磷酸 dNTP，整个构建过程还需要引物 缓冲体系 后续第二链合成相关酶类，和基因组 DNA 不一样，cDNA 不包含内含子，只保留已经转录并且经过剪接之后的编码序列，这也是它最关键的特点，构建 cDNA 一般分为单链 cDNA 合成，再继续合成互补的第二条链，最终得到双链 cDNA，之后通常会连接载体，构建成 cDNA 文库，分子生物学实验里面，原核表达经常使用 cDNA，就是因为原核生物没有内含子剪接系统，无法直接处理基因组 DNA 里面的内含子序列。

cDNA 构建核心组分对照表

cDNA 详细构建步骤

第一步提取纯化总 RNA，从细胞或者组织里面提取总 RNA，再分离富集带有 polyA 尾的成熟 mRNA，mRNA 质量是构建 cDNA 成败关键，降解的 mRNA 会得到短片段 cDNA。

第二步第一链合成，加入逆转录酶 引物 dNTP，以 mRNA 为模板合成单链互补 DNA，此时产物是 RNA DNA 杂合双链，也就是 mRNA 和单链 cDNA 结合在一起。

第三步降解模板 RNA，使用 RNase H 把杂合分子里面的 mRNA 部分切割降解，留下单链 cDNA。

第四步第二链合成，以单链 cDNA 作为模板，DNA 聚合酶合成互补第二条 DNA 链，得到完整双链 cDNA。

第五步末端处理，对双链 cDNA 进行补平 加接头或者酶切处理，方便后续插入质粒噬菌体等载体。

第六步载体连接与转化，把双链 cDNA 连接到克隆载体，导入宿主菌，得到 cDNA 文库，如果只是获取单个基因 cDNA，也可以直接 PCR 扩增目的片段，不一定构建文库。

两种引物选择区别

oligo dT 引物，识别 mRNA 末端 polyA 尾巴，优先从 3 端启动反转录，适合全长 cDNA 获取，但是如果 mRNA 很长，容易出现 5 端截短。

随机六聚体引物，随机结合 mRNA 任意位置，适合长 mRNA 或者没有 polyA 尾的 RNA，缺点是产物片段偏短，不容易拿到全长 cDNA。

cDNA 和基因组 DNA 核心差别

cDNA 模板来源是成熟 mRNA，已经完成剪接，没有内含子，启动子序列也不存在。

基因组 DNA 直接从细胞基因组提取，保留内含子 启动子 非编码区全部序列。

原核表达基因克隆一般选用 cDNA，真核基因组 DNA 不能直接在原核表达系统表达，因为原核不能剪切内含子。

综合总结

cDNA 由成熟 mRNA 作为模板，在逆转录酶催化下，利用 dNTP 作为原料反转录得到单链，再合成第二条链形成双链互补 DNA，整套构建流程核心就是反转录，后续可以连接载体做成 cDNA 文库，这个技术广泛用于基因克隆 原核真核表达 基因表达谱研究。

【相关 FAQ】

问题 1 cDNA 由什么构建，为什么 cDNA 没有内含子

回答 1 cDNA 由成熟 mRNA 反转录构建，成熟 mRNA 在真核细胞里面已经完成转录后剪接，内含子已经被切除，所以最终得到的 cDNA 不存在内含子序列。

问题 2 cDNA 由什么构建，逆转录酶的作用是什么

回答 2 cDNA 由什么构建，逆转录酶是构建 cDNA 的核心酶，它可以以 mRNA 作为模板，按照碱基互补配对合成第一条互补 DNA 链，完成反转录反应。

问题 3 cDNA 由什么构建，oligo dT 引物在构建 cDNA 起什么作用

回答 3 cDNA 由什么构建，oligo dT 引物可以结合 mRNA 的 polyA 尾，启动逆转录反应，是构建全长 cDNA 最常用的引物类型。

问题 4 cDNA 由什么构建，cDNA 文库和单基因 cDNA 是一回事吗

回答 4 cDNA 由什么构建，cDNA 文库是把全部 mRNA 反转录得到的所有双链 cDNA 全部克隆进载体，单基因 cDNA 只是单独某一个基因对应的互补 DNA，二者规模不一样。

【免责申明】

本内容为分子生物学基础实验知识科普，不同实验方案酶试剂选择会有差异，专业实验操作请参考正规实验手册与文献，本内容不替代专业实验指导。